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轉自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其核心就是DNA聚合酶。目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中很多都是使用野生型的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶等天然形式存在的酶。野生型的Taq聚合酶由于本身的結構導致功能有限，經(jīng)常會(huì )遇到如擴增效率低，特異性差，啟動(dòng)速度慢，模板GC含量異常等擴增不出的問(wèn)題。隨著(zhù)新興技術(shù)的發(fā)展，對DNA擴增酶的需求越來(lái)越高，能否進(jìn)行快速擴增、能否有效擴增復雜樣本、能否進(jìn)行多重擴增成為DNA擴增酶亟待解決的問(wèn)題。
2018年，來(lái)自加州理工學(xué)院的Frances H. Arnold教授因為“酶的定向進(jìn)化”這一領(lǐng)域的貢獻，獲得諾貝爾化學(xué)獎。定向進(jìn)化允許對酶功能進(jìn)行持續改進(jìn)，例如提高熱穩定性、比活性、持續合成能力或對抑制劑的抗性。Roche旗下Kapa Biosystems成功利用其定向進(jìn)化技術(shù)（Directed evolution technology platform）設計出KAPA2G快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶。KAPA2G快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶是抗體介導的熱啟動(dòng)聚合酶，具有更高的擴增性能和速度。其具有1 s/kb的延伸速度，相比于野生型Taq DNA聚合酶1min/kb的擴增速度，能夠極大地縮短總循環(huán)時(shí)間。在具有強大的擴增速度下，KAPA2G快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶同時(shí)具有相當強大的“耐受”能力，面對粗制樣本、GC異常樣本均具有優(yōu)秀的擴增能力。另外在多重擴增方面也表現優(yōu)秀。針對當前PCR面臨的“快速、穩健和多重”的痛點(diǎn)，KAPA2G系列分別能夠提供KAPA2G Fast、KAPA2G Robust和KAPA2G Multiplex三種類(lèi)型的產(chǎn)品，真正是PCR里的多、快、好、省。
KAPA2G系列產(chǎn)品適合的應用：
多重PCR擴增法醫學(xué)檢測多重擴增毛細管電泳檢測宏基因組測序mNGS病原靶向測序tNGS遺傳病多重擴增檢測
“多”重
—KAPA2G Fast HS Multiplex
KAPA2G Fast HS Multiplex試劑盒包含KAPA2G快速熱啟動(dòng)DNA 聚合酶。除了具有快速擴增速度外，KAPA2G Fast HS Multiplex還能提供更高的產(chǎn)量和靈敏度，與高度多重的PCR。
高通量測序現在已經(jīng)廣泛用于病原微生物和腫瘤檢測，但是不同起始樣本質(zhì)量參差不齊，部分樣本中某些基因豐度太低，直接進(jìn)行建庫測序可能導致結果不準確甚至出現漏檢。斯坦福大學(xué)的Zhang1等人利用KAPA2G Fast HS Multiplex進(jìn)行測序前的預擴增，能夠將樣本中靶基因豐度提升1000倍左右，有效的提高整體檢測準確性和完整度。另外NGS測序的結果驗證同樣重要，目前常用的方法是進(jìn)行RT-PCR驗證，常見(jiàn)的RT-PCR一次只能檢測一到二個(gè)基因。Miljani´c2等利用KAPA2G Fast HS Multiplex建立多重RT-PCR技術(shù)—mRT-PCR（Multiplex），能夠對測序結果進(jìn)行快速高效驗證。病原靶向測序技術(shù)是一種新型技術(shù)，將超多重PCR擴增與高通量測序兩種技術(shù)結合，可以對待測樣本中幾十種至幾百種的目標基因進(jìn)行檢測。這種方法的提前就是需要DNA擴增酶具有強大的多重擴增能力。Franken3等利用KAPA2G Fast HS Multiplex的超多重擴增能力，建立了一種基于靶向基因多重擴增高通量測序的方法，用于提高乳腺癌的靶向治療。
圖A：使用KAPA2G Fast Multiplex進(jìn)行快速多重PCR可以節省 40 – 60% 的時(shí)間。
圖B：使用KAPA2G Fast Multiplex進(jìn)行GC豐富的多重PCR（6 重）實(shí)驗，能夠有效擴增全部目標片段。
數據來(lái)源：羅氏診斷實(shí)驗室整理
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KAPA2G Fast Multiplex特點(diǎn)：
01
節省時(shí)間
預混液無(wú)需過(guò)多優(yōu)化，對多重PCR體系縮短循環(huán)時(shí)間高達60%
02
強勁多重性能
KAPA2G Fast Multiplex對應對富含GC或AT序列的靶標均具有優(yōu)秀性能，同時(shí)對體系中超多重靶標擴增具有優(yōu)秀均一性
“快”速
—KAPA2G Fast
KAPA2G Fast試劑盒是一款旨在解決快速PCR的產(chǎn)品。相比于野生型Taq聚合酶，其有用更高的合成能力和速度。除了超快的擴增速度，KAPA2G Fast還提供能夠具有更高的擴增效率和擴增能力。
圖A：KAPA2G Fast HotStart聚合酶有效擴增5個(gè)不同大小的人基因片段，其中延伸時(shí)間為1秒/循環(huán)。
圖B：使用野生型Taq DNA聚合酶和KAPA2G Fast DNA聚合酶擴增人基因組DNA (≤3.5 kb) 和lambda (≤5 kb)不同長(cháng)度片段的總反應時(shí)間，反應時(shí)間基于試劑盒推薦的35循環(huán)程序。
數據來(lái)源：羅氏診斷實(shí)驗室整理
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KAPA2G Fast特點(diǎn)：
01
節省寶貴時(shí)間
延伸時(shí)間可達到1秒/kb，減少PCR反應時(shí)間達75%
02
應對復雜模板
覆蓋高AT和高GC含量的靶標
03
持續提升PCR反應的開(kāi)發(fā)
熱啟動(dòng)和即用型制式
“好”擴
—KAPA2G Robust
KAPA2G Robust試劑盒通過(guò)更高的合成速率和特異性賦予PCR更加強健的表現、更高的靈敏度和更好的常規反應抑制劑耐受能力。KAPA2G Robust試劑盒適用于復雜困難樣本類(lèi)型等具有挑戰性的PCR應用，無(wú)需在酶類(lèi)選擇和反應方案層面的過(guò)多優(yōu)化。
進(jìn)行PCR反應過(guò)程中是常常會(huì )遇到模板異常的情況，比如粗制提取，含有各種PCR抑制物，或者GC豐度異常的樣本，這類(lèi)型樣本在進(jìn)行高通量測序時(shí)難以直接進(jìn)行建庫，非?？简灲◣霥NA酶擴增能力。TERT（telomerase reverse transcriptase）啟動(dòng)子突變的檢測是診斷膠質(zhì)母細胞瘤的關(guān)鍵因子，然而TERT啟動(dòng)子的GC含量在80%以上，一般的DNA聚合酶難以進(jìn)行擴增。Ward4等利用KAPA2G Robust對模板高GC的耐受能力，成功擴增TERT啟動(dòng)子并開(kāi)展下游的測序工作。
圖A：使用KAPA2G Robust和野生型Taq 聚合酶，在四種常見(jiàn)PCR抑制劑存在的條件成功擴增出從1pg質(zhì)粒DNA擴增1.5kb片段。
圖B：使用KAPA2G Robust對72種不同GC含量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴增。
數據來(lái)源：羅氏實(shí)驗室整理
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KAPA2G Robust特點(diǎn)：
01
輕松應對粗提樣本
KAPA2G Robust對抑制劑殘留和粗提樣本PCR有很高的耐受能力（例如FFPE樣本）
02
在具有挑戰性的應用中實(shí)現高靈敏度
每單位酶呈現高得率
03
提升復雜困難樣本的 PCR 表現
應對富含GC和AT序列的靶標并且減少您的反應優(yōu)化時(shí)間
“省”心
—羅氏診斷的品質(zhì)保證
羅氏生命科學(xué)部的工業(yè)原料產(chǎn)品作為羅氏產(chǎn)品大家族中的一員，秉承了羅氏公司一貫堅持的高品質(zhì)特性，為各生產(chǎn)企業(yè)、大型研究所、研發(fā)中心等提供上佳的原料來(lái)源，包括分子診斷、臨床生化、免疫檢測和生物制藥等各應用領(lǐng)域。除了高品質(zhì)的產(chǎn)品外，提供高水準的產(chǎn)品服務(wù)和技術(shù)服務(wù)也是羅氏診斷致力追求的目標。我們期待著(zhù)和您攜手共進(jìn)，贏(yíng)向未來(lái)。
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產(chǎn)品 |
規格 |
貨號 |
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KAPA2G Fast HS |
12500U |
7983239001 |
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KAPA2G Robust Hotstart Ready Mix預混液 |
12.5mL |
08041113001 |
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KAPA2G Fast HS Multiplex預混液 |
50mL |
09077898001 |
參考文獻：
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Zhang R, Li X, Ramaswami G, et al. Quantifying RNA allelic ratios by microfluidic multiplex PCR and sequencing. Nature methods, 2014, 11(1): 51-54.
-
Miljani? V, Jakše J, Rusjan D, et al. Small RNA Sequencing and Multiplex RT-PCR for Diagnostics of Grapevine Viruses and Virus-like Organisms. Viruses, 2022, 14(5): 921.
-
Franken A, Rivandi M, Yang L, et al. A multiplex PCR-based next generation sequencing-panel to identify mutations for targeted therapy in breast cancer circulating tumor cells. Applied Sciences, 2020, 10(10): 3364.
-
Ward D G, Baxter L, Gordon N S, et al. Multiplex PCR and next generation sequencing for the non-invasive detection of bladder cancer. PloS one, 2016, 11(2): e0149756.
*不用于臨床診斷。MC-CN-02503 有效期至2025年11月8日。
END
